走在新一代免疫細胞療法路上,通用型CAR-T面臨安全挑戰

醫藥電商
生物制藥小編
At.Zhou
2018-03-30 · 08:01
[ 億歐導讀 ] 2017年被稱為細胞免疫治療元年,Novartis的CAR-T產品Kymriah和Kite的產品Yescarta的獲批上市,而CAR-T與基因編輯合作,其碰撞的火花將會促進新一代細胞免疫治療的發展。
癌癥,醫療,醫藥,CAR-T,免疫細胞療法,基因編輯

在今年2月23號,Gilead旗下公司Kite與Sangamo Therapeutics達成全球合作,使用Sangamo的鋅指核酸酶ZNFs技術平臺開發下一代腫瘤學離體細胞治療。根據協議的條款,Sangamo將獲得1.5億美元的預付款,并有資格獲得高達30.1億美元的潛在付款。

這并不是CAR-T與基因編輯的第一次合作,早在2015年1月,Novartis宣布與Intellia Therapeutics展開一項長達5年的研發合作計劃,主要致力于加速發展CRISPR/Cas9技術在CAR-T細胞治療的應用;同年5月,Juno與Editas簽訂了一項為期三年的合作協議,將借助Editas公司開發的CRISPR/Cas9技術輔助公司現在開發的CAR-T療法和TCR療法治療更多類型的腫瘤類型,這項協議包括了4700萬美元預付款和6億9千萬美元的里程碑獎金。

2017年可以被稱為細胞免疫治療元年,Novartis的CAR-T產品Kymriah和Kite的產品Yescarta的獲批上市,極大地推動了細胞免疫治療研發的熱情,而CAR-T與基因編輯合作,其碰撞的火花將會促進新一代細胞免疫治療的發展。

現在絕大多數的CAR-T臨床實驗都是使用的自體型CAR-T,但是病人自身的T細胞通常都存在質量與數量的缺陷;且自體型CAR-T的生產成本更加昂貴,大約為通用型CAR-T的五倍;自體型CAR-T需要私人定制,而通用型CAR-T能夠做到現貨供應(off-the-sheff),節約時間。

然而異體型T細胞上的抗原受體TCR可能會識別接受者體內的異體抗原,從而引發移植物抗宿主?。℅VHD);此外,異體T細胞上的HLA表達也會迅速地引起宿主免疫細胞排斥反應。因此使用ZFNs,TALENs以及CRISPR/Cas9等基因編輯工具,敲除異體T細胞上的TCR,MHC以及相關信號通路基因,從而防止異體型CAR-T的宿主排斥反應,是實現通用型CAR-T的關鍵一步。此外敲除PD1與CTLA4等T細胞抑制信號分子,能夠進一步增強CAR-T細胞的功能。

此次與Kite達成合作的Sangamo是ZFNs技術的專利擁有者,Sangamo目前有多項使用ZFNs基因編輯治療罕見病臨床試驗正在進行中。Editas Therapeutics與Intellia Therapeutics則是基因編輯技術CRISPR/Cas9的領跑者,其創始人分別為學術大牛張峰和Jennifer Doudna。而走在通用型CAR-T研發最前沿的是法國公司Cellectis,其利用自身Talens技術平臺研發的UCART已處于臨床階段。本文將主要介紹UCART的產品和生產過程,以及CRISPR/Cas9技術用于編輯CART細胞的最新進展。

UCART產品介紹

UCART與自體型CAR-T有一些共同特征:它們都由慢病毒轉染從而攜帶識別腫瘤上特定抗原的嵌合抗原受體CAR;它們通過CAR識別腫瘤細胞從而發揮殺傷作用。UCART的獨特點在于原材料是健康捐獻者的血液,并不依賴于病人的淋巴細胞;并非定制的細胞療法,而是能夠現貨供應,為更多的病人提供治療;UCART通過TALEN基因編輯技術,敲除TCR等相關基因,避免移植物抗宿主病,敲除PD1等免疫檢查點,進一步增強CAR-T細胞的功能。

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Cellectis公司UCART簡介

目前Cellectis公司有兩款UCART產品正處于臨床實驗階段,UCART19和UCART123。其中UCART19攜帶靶向CD19的CAR,主要用于治療急性淋巴白血?。ˋLL);UCART123攜帶靶向CD123的CAR,CD123主要在急性髓細胞性白血?。ˋML)以及BPDCN的白血病細胞上表達。

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UCART19和UCART123

UCART19和UCART123都采用的是第二代CARs,使用了鼠源的scFV,含有41BB和CD3ζ兩個共激活結構域;此外在CAR上還添加了一個RQR8基因,RQR8是一個136aa的蛋白,它能夠被CD34的抗體QBEnd10識別,因此能夠通過Miltenyi CliniMACS的CD34篩選系統進行臨床級別的分選;此外RQR8還含有兩個利妥昔單抗的模擬表位,能夠在發生安全問題時,通過利妥昔單抗迅速清除CAR-T細胞。

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UCART的CAR構建設計

此外,對于UCART19和UCART123,它們都是用了TALEN技術敲除了TRAC基因,從而降低了移植物抗宿主病的風險。在UCART19中還額外敲除了CD52基因,由于在注射UCART19細胞前,急性淋巴細胞白血病ALL患者通常需要接受淋巴細胞耗竭的化療與anti-CD52(alemtuzumab)血清療法,因此UCART中敲除CD52基因能夠避免UCART產品受到alemtuzumab的影響。

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UCART19 TALEN設計與TALEN轉染后蛋白表達水平

UCART GMP生產過程

UCART的生產過程與自體CART大體上類似,不同點在于UCART的原材料是健康捐獻者的血液而非病人自身的血液,其次UCART生產過程中多了一步,引入基因編輯工具敲除某些特定基因。在目前的自體型CART生產工藝中,Kite的工藝最為簡便,周期也最短,為10天左右;Novartis的生產工藝最為標準,經過后期優化后周期仍有22天;Juno的生產周期在14-18天左右。目前UCART的GMP生產周期大約為19天,其具體過程如下。

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UCART GMP生產過程

UCART初始材料:健康捐贈者細胞

首先從健康的美國捐獻者血液中分離單核細胞(MNCs),這些捐獻者血液來自FDA批準的,加利福尼亞州批準的,美國血庫協會(AABB)認可的,臨床試驗標準(CLIA)認證的血庫。

所有的捐獻者都需要經過挑選,篩選(采集前的14天內)和檢測(采集的當天)。
所有的人類細胞的捐獻,獲得,檢測,加工和存儲都遵循歐盟和美國的相關法規和指導意見。

從MNCs中分離淋巴細胞(一般的產量大于4x109 cells),一次UCART生產的初始細胞數目通常為收集到細胞的1/5-1/3(109 cells左右)。

Day1到Day4:第一次T細胞改造(慢病毒感染)

使用識別CD3/CD28的抗體偶聯beads激活T細胞。
使用GMP級別的,由第三代慢病毒載體包裝的慢病毒感染激活的T細胞,使得RQR8與相應的CAR在T細胞中表達。

Day5: 第二次細胞改造(TALEN介導的基因編輯)

將GMP級別的TALEN編碼的mRNA通過電轉轉入到經過第一次改造的T細胞中,使TALEN瞬時表達。

TALEN能夠識別和切割TRAC與CD52基因組DNA,形成的DNA雙鍵裂斷由非精準的NHEJ修復方式修復從而導致TRAC與CD52基因的敲除。

Day6到Day17:細胞擴增

在可控的培養系統中將細胞擴增到1011 cells左右。

Day18-19:細胞純化與分裝
使用抗體-磁珠偶聯的beads,分選純化出TCRαβ陰性的T細胞。(此為一個重要的放行標準)

細胞的分裝與凍存。每個產品一般都會有2-3種劑量形式,用以滿足可能的劑量遞增需求。

UCART的QC標準
雖然現在還沒有詳盡的法規來規定CART產品的QC標準,但是CART產品還是需要一系列的質量檢測。其中產品的純度,即≥97%的TCRαβ陰性細胞是一個重要的放行標準。此外產品的無菌性,內毒素,支原體,以及是否含有可復制的慢病毒都需要進行一系列檢測。產品對于目標細胞的響應(包括相關細胞因子的釋放與細胞殺傷活性)也應該被檢測。

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UCART的QC標準

UCART19與UCART123臨床結果

在2017年12月的ASH會議上,Cellectis公布了UCART19的兩個臨床實驗的初步結果。在CALM (UCART19 in Advanced Lymphoid Malignancies)劑量爬坡實驗中,6名成人R/R B-ALL患者接受了低劑量的UCART19治療,該劑量為自體型CART實驗中劑量的1/10。實驗中UCART19顯示出了可控的安全性和較好的緩解率,只有一名出現了1級的GvHD。所有的6名患者都出現了細胞因子釋放風暴(CRS),其中5人為輕度的1-2級,但能夠通過IL6R抑制劑tocilizumab克服;其中一名患者出現了4級CRS和敗血癥,并在第15天后死亡。

另外的兩個高劑量會在接下來的實驗中進行。在PALL(Pediatric Acute Lymphoblastic Leukemia)實驗中,5名患兒接受了固定劑量的UCART19(2x107 total cells or 1.1 to 2.3x106 cells/kg),所有患兒都在4-8天都出現了1-3級的細胞因子釋放CRS,但是是可以克服的。在第28天,所有的患兒都取得了完全的緩解,但是在3個月后,兩個患兒復發,并且分別在第7個月和第八個月死亡。另一個患兒死于血栓性微血管病,腎炎等移植并發癥。剩下的兩個患兒目前分別在移植2個月和2.5個月的緩解期。

然而UCART123的臨床實驗頗為不順,在2017年9月UCART123在治療BPDCN一期臨床試驗中出現了一例病人死亡,該病人在第8天經歷了5級的CRS和4級的CLS,并在第9天死亡。在UCART123在治療AML的一期臨床試驗中,一位病人在第9天經歷了3級的CRS和4級的CLS,但最終脫離了生命危險。目前UCART123的兩個臨床實驗已經被FDA叫停。

UCART123的安全性問題可能出在靶點CD123上,由于CD123雖然在腫瘤細胞過度表達,但正常細胞也有表達。強生和Genmab的CD123/CD3雙特異抗體JNJ63709178去年發生一例嚴重毒副反應,臨床試驗被暫時叫停。Stemline的免疫毒素(CD123/白喉毒素)年初也在一個BPDCN臨床試驗中造成三例CLS死亡事件。

安全性問題一直是CAR-T細胞治療中的重中之重,2017年JUNO的CAR-T產品就因為出現兩次病人死亡情況被FDA叫停,從而被Novartis和Kite超越。而對于通用型CART,其面臨的安全性問題壓力更大,UCART123被叫停,UCART19雖然還未出現與產品相關的嚴重副作用,但是臨床試驗中也出現了多名患者死亡。因此,通用型CAR-T的設計和優化,以及臨床實驗中出現的CRS等都應該被小心對待。

CRISPR/Cas9與T細胞編輯

CRISPR/Cas9是現在應用最廣泛,研究最深入的基因編輯工具。與TALENs和ZFNs相比,CRISRP/Cas9的精確性更高,能降低脫靶效應帶來的副作用;設計簡單,更利于規?;a。雖然Novartis和Juno早在2015年就開始與CRISPR相關公司合作開發下一代CAR-T產品,但是現在還沒有更多進展更新被報道。

采用CRISPR/Cas9編輯T細胞基因組是相當困難的,CRISPR/Cas9的delievry方法主要包括慢病毒,腺病毒,AAV等病毒載體遞送,使用質?;蛘吆颂呛说鞍識NP電轉,或者是使用編碼Cas9的mRNA與sgRNA共電轉。雖然使用質粒DNA核轉能夠編輯T細胞基因,但是DNA核轉對于T細胞的毒性非常大,不利于T細胞編輯的大規模應用。

在2015年,研究者們使用CRISPR首次成功編輯了T細胞,他們使用的是Cas9蛋白與sgRNA的RNP復合物電轉,其編輯效率能夠達到55%。隨后研究者們使用了編碼Cas9的mRNA與sgRNA共電轉,其編輯效率也能夠達到60%以上。雖然研究者們也成功使用了慢病毒,AAV等病毒載體遞送CRISRP/Cas9進行T細胞編輯,但是其編輯效率很低。目前病毒載體在T細胞中效率低的原因還不得而知,可能的一個猜測是在T細胞中,需要快速大量的表達Cas9蛋白。

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利用不同方法遞送CRISPR/Cas9進行T細胞編輯

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各種CRISRP/Cas9的遞送方式在編輯T細胞時的比較

T細胞編輯的一個挑戰是如何能在較短的時間窗口,完成高效的基因編輯。由于激活的T細胞比na?ve T細胞更容易接受外源的核酸與蛋白質,但是多次刺激T細胞會導致T細胞衰竭,腫瘤殺傷能力降低,因此在生產T細胞產品時需要優化好實驗步驟,以達到高效的編輯。目前比較通用的方法是在T細胞激活后的Day1,使用慢病毒轉染表達CAR,在Day3和Day4使用RNPs或者編碼Cas9的mRNA與sgRNA進行電轉,最終得到的CART產品中能達到>70%的CAR轉導效率與>60%的基因編輯效率。

此外,為了達到敲除多個基因的目的,使用多個sgRNA共轉T細胞可能會產生較高的細胞毒性;使用Cas9 RNP多元復合物會降低細胞毒性,但是會損失一定的編輯效率。有研究者開發了One-shot CRISPR system,將多個sgRNA組裝進了CAR所在的慢病毒載體中,這樣就只需要在Day3單獨電轉Cas9的mRNA就能夠達到編輯的效果,從而減少多個共轉造成的細胞毒性。此外,如何提高慢病毒或者AAV遞送CRISPR/Cas9編輯T細胞的效率,也是降低通用型CART生產成本,擴大生產規模的重要因素。

小結

安全性問題一直是CAR-T細胞治療中的重中之重,通用型CAR-T面臨著更大的安全性考驗。在能保證安全性的條件下,通用型CAR-T與自體型CAR-T相比有著明顯的優勢。希望Cellectis的UCART臨床實驗帶來更多令人振奮的結果與信息,希望CRISPR/Cas9技術能在T細胞編輯上有更大地突破,也希望CAR-T巨頭和基因編輯公司的強強聯合,早日為我們帶來新一代的免疫細胞療法。

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